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RNA甲基化是表觀遺傳學領域的研究熱點，也是高分文章的寵兒，目前大熱點有m6A、m5C、m1A RNA甲基化，尤其m6A修飾熱度只增不減，那么，本期我們繼續(xù)m6A。這次分享的文章是發(fā)表在Nature Cell Biology上的“Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation”，文章是關于造血干細胞（HSC）的研究，也關于m6A，主角分子依舊是Mettl3蛋白。

本文所有圖片及數據均來源于：Lee, H., et al. "Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation." Nature cell biology (2019).

研究背景：造血干細胞（HSCs）維持平衡的自我更新和分化，但這些功能如何被精確調節(jié)尚不完全清楚。m6A mRNA甲基化已成為影響許多生物過程中轉錄基因表達調控的重要模式。基于這些，作者開展了實驗。利用Lysm-cre轉基因技術小鼠Mettl3條件敲除后，髓系細胞的數量和功能并未被影響HSCs分化受阻。Myc的轉錄本是m6A最主要修飾靶基因，對HSC細胞進行MeRIP-seq，發(fā)現，Mettl3缺失的HSC細胞中，MYC的表達量下降，挽救實驗中增加分化刺激因素或者人為上調表達MYC基因，都可以使得挽救HSC的分化功能缺陷。

研究結果：

1、Mettl3蛋白敲除后HSC細胞大量堆積

根據已有研究報道，HSCs可以直接產生血小板，通過腹膜注射pIpC到敲除Mettl3的Mx1-cre中，通過全血細胞計數分析顯示Mx1-cre中血小板計數顯著降低；Mettl3^fl/fl小鼠與pIpC處理的對照相比，白細胞計數也顯著降低且分布改變，這表明m6A與造血功能相關；在pIpC最后一次注射，10天時，Mettl3的缺失導致髓系細胞的數量顯著減少，脾細胞無變化；注射后2-4個月，除髓系細胞的數量顯著減少之外，脾臟大小及細胞構成反而增加；在骨髓中，LSK和HSCs在檢測的時間點都有增加，且HSCs在最后一次pIpC注射后10-14天到4個月持續(xù)增加，而LSK只是略有增加；另外，觀察到Lin-Scal-cKit+CD150+CD41巨核細胞和CD41巨核細胞與對照相比顯著增加。所有相關數據表明Mettl3的喪失導致HSC細胞堆積，并且影響巨核細胞譜系。

2、Mettl3蛋白缺失阻礙HSCs正常分化

BrdU注射Mx1-cre鼠，檢測細胞周期、細胞死亡等指標，結果發(fā)現：Mettl3^fl/fl小鼠與對照相比，BrdU摻入并沒有大的差異，但是細胞死亡顯著增加；另外，使用5-氟尿嘧啶處理pIpC注射的Mx1-cre小鼠時，Mettl3^fl/fl小鼠的存活率低于對照組；這說明HSCs的積累可能是分化受阻而非自我更新增強。而后作者進一步利用甲基纖維素檢測HSCs的分化能力，與對照相比，喪失Mettl3的HSCs形成集落更少且菌落更小，作者利用流式細胞術分析，發(fā)現這些細胞是不能分化的；但是，當Mettl3缺陷的髓系細胞接種到甲基纖維素中時，與對照相比，形成的集落在數量，大小和類型上相似，且這些菌落含有正常數量的分化細胞。這表明Mettl3的缺失導致HSCs的分化受阻，但在體外限制性祖細胞中不存在此現象。

3、Mettl3是HSCs分化過程的必需分子

為了測試Mettl3的缺失是否導致體內HSCs缺陷，作者通過利用Mx1-cre的500,000個髓系細胞進行競爭性重組測定。 發(fā)現HSCs水平有降低趨勢；作者將Mettl3缺陷型和對照HSCs以及野生型競爭性髓系細胞分選出來，并移植到致死量照射的小鼠中，移植對照HSCs的受體鼠能夠重組主要造血譜系，但缺乏Mettl3的HSCs不能重組，缺陷主要發(fā)生在骨髓和B譜系中，且缺乏Mettl3的HSCs在自我更新上基本是正常的，但是隨著分化層次推移，所分化的造血細胞逐漸減少；這表明Mettl3缺陷型HSCs在造血重組方面存在缺陷，且Mettl3是HSCs分化過程的所必需的。

4、骨髓細胞生成不需要Mettl3

作者在Lysm-cre中敲掉Mettl3蛋白，6-8周齡的鼠各細胞參數正常（外周血、骨髓、脾細胞等參數），且都可以形成正常形態(tài)的巨噬細胞；當受到脂多糖攻擊時，顯示出的炎性細胞因子Tnfa，Il1b和Il6均正常上調；Mettl3缺陷型骨髓細胞也顯示出強烈的吞噬活性，這個現象與對照相似；這說明Mettl3不是成熟骨髓細胞維持功能所必需的，但HSCs在體內造血分化期間對Mettl3和m6A的階段特異依賴。

5、鑒定HSC中與m6A作用的靶基因

利用MeRIP-seq技術鑒定，發(fā)現在對照小鼠中，富集了2073個轉錄產物，而在Mettl3缺陷型HSCs的Mx1-cre中，經過pIpC處理10天，只富集了995個轉錄產物，與對照相比，顯著降低；這說明m6A修飾與Mettl3蛋白的表達密切相關。此外，Myc, Junb 和 Tet2被認為是m6A修飾的主要靶基因，在Mettl3缺陷型HSCs中，這些基因的表達量也下調。

6、Mettl3介導的m6A會改變HSCs特性

作者在Mettl3缺陷型HSCs中找到384個上調基因，其中95個是m6A靶標，將基因分為m6A靶基因和非m6A靶基因，通過MeRIP-seq，發(fā)現與非m6A靶標相比，m6A靶標的轉錄物在Mettl3缺陷型HSC中具有略微增加的豐度，根據已有研究報導，在HSC中MYC蛋白水平非常低，在通過轉錄機制進行分化后被上調，MYC的缺失阻斷HSCs分化，而更高水平的MYC蛋白可以促進HSCs分化，這個現象與Mettl3缺陷型HSCs的表型相似，因此，作者進一步通過MeRIP-seq技術檢測，發(fā)現Mettl3缺陷型HSCs中MYC轉錄物水平沒有顯著變化，但是，GSEA基因富集分析結果發(fā)現Mettl3缺陷型HSCs中Myc-靶基因特征的顯著降低，表明m6A可能主要調節(jié)Myc mRNA翻譯，進一步在MYC蛋白中插入GFP蛋白，用來檢測MYC蛋白表達量，結果：Mettl3的缺失導致HSCs中MYC-GFP的表達顯著降低，在激活HSCs分化后，對照HSCs的MYC-GFP表達上調，而Mettl3缺失型HSCs的MYC-GFP表達不能上調，這說明m6A是HSC中Myc mRNA翻譯所必需的，特別是在分化后。并且將Myc強制表達可以挽救由Mettl3缺失引起的HSCs分化缺陷。

文章總結：利用Lysm-cre轉基因技術小鼠Mettl3條件敲除后，髓系細胞的數量和功能并未被影響，但HSCs分化受阻；Myc的轉錄本是m6A最主要修飾靶基因，對HSC細胞進行MeRIP-seq，發(fā)現，Mettl3缺失的HSC細胞中，MYC的表達量下降，挽救實驗中增加分化刺激因素或者人為上調表達MYC基因，都可以使得挽救HSCs的分化功能缺陷；Mettl3所介導的m6A是HSCs分化過程中所必須的。